如何選擇HPLC制備柱
沃特世制備柱應(yīng)用選擇快速推薦表
應(yīng)用類(lèi)型 | 色譜柱品種 | 應(yīng)用特色 |
常規(guī)反相制備 | XBridge C18：實(shí)驗(yàn)室必備柱 | ●BEH 雜化顆粒技術(shù)，柱耐受性與通用性更好，pH 1-12。 ●尤其適用于對(duì)胺基類(lèi)化合物選擇高pH 條件以獲得更好的保留與載量。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH C18 完全一致。 |
常規(guī)反相制備 | SunFire C18：實(shí)驗(yàn)室必備柱 | ●高純硅膠C18，pH 2-8。載量大、分辨率高，在中-低pH 使用范圍內(nèi)通用性極佳。 ●特別適用于要求高分辨、高載量的痕量組分制備。 ●對(duì)于胺基類(lèi)化合物，當(dāng)需要使用低pH 條件、甚至甲酸體系時(shí)，峰形佳。 |
常規(guī)反相制備 | XSelect CSH C18：實(shí)驗(yàn)室必備柱 | ●CSH 雜化顆粒技術(shù)，柱耐受性與通用性極佳，pH 1-11。 ●切換氨水/ 甲酸反相體系時(shí)柱平衡迅速，特別適用于配MS 引導(dǎo)的制備純化系統(tǒng)。對(duì)胺基類(lèi)化合物峰形卓越。 ●色譜選擇性與ACQUITY CSH C18 完全一致，可先用UPLC 進(jìn)行pH 條件切換篩選，再放大到純化系統(tǒng)進(jìn)行制備。 |
極性較大和/或疏水性強(qiáng)的化合物 | Atlantis T3 | ●高純硅膠C18，pH 2-8。有效增強(qiáng)對(duì)極性化合物的反相保留，三鍵鍵合C18不易流失，與100% 水相完全兼容，與MS檢測(cè)完全兼容。 ●同時(shí)對(duì)強(qiáng)疏水性化合物的保留減弱，有助于減少有機(jī)溶劑耗量，并提高對(duì)強(qiáng)保留化合物的制備回收率。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC HSS T3 柱類(lèi)似。 |
反相無(wú)法保留的高極性化合物 | XBridge Amide | ●BEH 雜化顆粒基質(zhì)，三鍵鍵合酰胺基，耐受性與通用性極佳，pH 2-11。 ●按HILIC 原理保留高極性化合物，尤其適用于酸性化合物(如膦酸類(lèi))、中性化合物(如寡糖類(lèi)或多羥基類(lèi))或混合組分樣品。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH Amide 完全一致。 |
反相無(wú)法保留的高極性化合物 | XBridge HILIC | ●BEH 雜化顆粒基質(zhì)，無(wú)鍵合相，耐受性?xún)?yōu)于硅膠基質(zhì)柱，pH 1-9。 ●按HILIC 原理保留高極性化合物，尤其適用于堿性化合物(如季銨鹽類(lèi))。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH HILIC 完全一致。 |
芳香類(lèi)化合物或苯基柱應(yīng)用 | XBridge Phenyl | ●BEH 雜化顆粒技術(shù)，柱耐受性極佳，pH 1-12。 ●苯基鍵合相對(duì)芳香類(lèi)化合物有特殊的選擇作用。三鍵鍵合苯基有效增強(qiáng)鍵合相耐受性與柱壽命。 ●當(dāng)分離目標(biāo)還具有胺基或羧基官能團(tuán)時(shí)，可利用不同pH 條件下的選擇性提高載量和分離度。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH Phenyl 柱完全一致。 |
合成肽 | PST 肽分離技術(shù)柱： XBridge BEH130 C18 XBridge BEH300 C18 | ●BEH 雜化顆粒技術(shù)，柱耐受性與通用性好(pH 1-12)，尤其適用于肽分離時(shí)常用的TFA 體系及較高溫度。 ●填料經(jīng)肽混標(biāo)質(zhì)控，以確保批次重現(xiàn)性。 ●有130? 和300? 兩種孔徑可供選擇。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC BEH130 C18 或BEH300 C18 完全一致。 |
合成寡核苷酸 | OST 寡核苷酸分離技術(shù)柱 | ●BEH 雜化顆粒技術(shù)，柱耐受性與通用性好(pH 1-12)，尤其適用于寡核苷酸分離純化所需的高鹽、高溫條件。 ●填料經(jīng)寡核苷酸混標(biāo)質(zhì)控，以確保批次重現(xiàn)性。 ●色譜選擇性與ACQUITY UPLC OST C18 柱完全一致。 |
從分析柱到制備柱直接放大，常用計(jì)算公式：
放大倍數(shù)-用于估算上樣量：
流速放大估算：
流速可用于計(jì)算與分析柱應(yīng)用時(shí)完全相當(dāng)?shù)木€(xiàn)性流速條件下對(duì)應(yīng)于更大色譜柱的體積流速。但是，合理的流速將取決于柱規(guī)格。當(dāng)柱長(zhǎng)增加、粒徑減小時(shí)，柱背壓會(huì)相應(yīng)增加，會(huì)受到液相系統(tǒng)耐壓性的限制。
梯度持續(xù)時(shí)間估算：
制備柱上樣量預(yù)估
對(duì)于OBD制備柱的大概上樣量(毫克)，梯度洗脫模式時(shí)：
1合理流速取決于柱內(nèi)徑。隨柱長(zhǎng)增加及填料粒徑減少，柱背壓增大，使用時(shí)會(huì)受到液相設(shè)備的耐壓性的限制。在制備柱上的梯度持續(xù)時(shí)間，應(yīng)按照與分析柱應(yīng)用時(shí)相等的梯度洗脫體積與柱體積之比的倍數(shù)因子計(jì)算(計(jì)算公式見(jiàn)“梯度持續(xù)時(shí)間估算"公式)。
2此處進(jìn)樣體積數(shù)值基于50 mm柱長(zhǎng)并使用較強(qiáng)溶劑溶解樣品時(shí)。如增加柱長(zhǎng)，進(jìn)樣體積亦可增加，但并不成正比。使用較弱強(qiáng)度的溶劑溶解樣品，能顯著提高進(jìn)樣體積量。
制備柱的樣品載量受制于許多因素。左邊所列數(shù)據(jù)僅為“平均狀況下"的預(yù)估值。通常規(guī)律有：
■ 強(qiáng)保留的目標(biāo)物載量較大
■ 樣品簡(jiǎn)單時(shí)載量較大
■ 需要高分辨時(shí)載量降低
■ 樣品載量受上樣條件影響很大：
- 受限于樣品體積
- 受限于樣品溶劑的強(qiáng)度
■ 對(duì)于肽樣品，其載量主要取決于目標(biāo)肽序列以及肽樣品的溶解性，建議按所列值的5-20%預(yù)估*。
裝填技術(shù)與柱硬件對(duì)性能的影響
實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的HPLC分離純化對(duì)色譜工作者提出了諸多挑戰(zhàn)，其中一個(gè)最大的挑戰(zhàn)是制備色譜柱本身。由于柱與柱之間在性能和使用壽命上的不一致性，常常導(dǎo)致樣品損失、重復(fù)純化操作以及從小體積柱到大體積柱的放大能力差。沃特世科學(xué)家意識(shí)到這個(gè)問(wèn)題的存在，歷經(jīng)三年，研究了裝填工藝過(guò)程中的所有因素以及柱設(shè)計(jì)本身。在此基礎(chǔ)上，沃特世公司于2003年推出了專(zhuān)利*技術(shù)OBDTM(Optimum Bed Density，最佳柱床密度)應(yīng)用于沃特世制備
柱產(chǎn)品。(*UK專(zhuān)利號(hào) # GB2408469)。
問(wèn)題的根本原因就是在于，制備柱的柱床裝填必須足夠致密，才能在使用過(guò)程中能夠承受流動(dòng)相壓力而仍保持穩(wěn)定的柱床狀態(tài)。傳統(tǒng)的勻漿裝填方法，用于分析柱規(guī)格時(shí)能夠產(chǎn)生必需的柱床密度；但是當(dāng)用于制備柱并使用較小粒徑填充制備柱時(shí)，隨著柱內(nèi)徑與長(zhǎng)度的增加，就越來(lái)越難以達(dá)到柱長(zhǎng)期使用仍能保持穩(wěn)定耐受時(shí)所必需的柱床密度。柱床密度的優(yōu)化，取決于色譜填料的特定性質(zhì)與所采用的柱設(shè)計(jì)。
沃特世OBD色譜柱設(shè)計(jì)
沃特世已將高壓勻漿填充與經(jīng)過(guò)仔細(xì)計(jì)算的軸向壓縮因素相結(jié)合，應(yīng)對(duì)于柱頭裝填密度較小的部分。
按照制備柱OBD設(shè)計(jì)理念，并按每種填料類(lèi)型和每種柱規(guī)格的立體幾何學(xué)加以精心微調(diào)的實(shí)際操作工藝，就可以獲得可預(yù)測(cè)的、對(duì)整個(gè)柱床長(zhǎng)度都均勻一致的裝填密度。在裝填結(jié)束后的封柱過(guò)程中，沃特世柱裝填操作依從仔細(xì)嚴(yán)格的操作流程，從而確保不會(huì)以任何不均勻的方式過(guò)度壓縮或擾動(dòng)柱端部分。
OBD制備柱硬件設(shè)計(jì)包括一對(duì)精心設(shè)計(jì)的分流板和化學(xué)惰性密封圈，以防止在高壓操作下出現(xiàn)漏液情況。
OBD制備柱裝配件圖解
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